Методы молекулярно генетического анализа реферат

Морфологическая диагностика опухолей: сдвиг в сторону молекулярно-генетического анализа

Александр Иванцов, кандидат медицинских наук,
Максим Клещёв, кандидат медицинских наук,
Екатерина Кулигина, кандидат биологических наук,
НМИЦ онкологии им. Н. Н. Петрова МЗ РФ (Санкт-Петербург)
«Природа» №6, 2018

Диагностика онкологических заболеваний начинается с морфологического анализа фрагмента пораженного органа, который зафиксирован в формалине, обезвожен в спиртах восходящей плотности и заключен в парафин. Данная процедура позволяет выполнить срез толщиной 3 мкм и поместить его на стекло, затем окрасить ядра клеток и другие базофильные структуры ярко-синим щелочным красителем гематоксилином, а цитоплазму — розовым кислым красителем эозином. Окрашивание позволяет четко визуализировать основные элементы клетки. Затем сопоставляют микроскопический «пейзаж» исследуемого образца с эталонным, на котором зафиксирована характерная для конкретной анатомической области гистологическая структура. О присутствии инвазивного неопластического процесса свидетельствуют утрата типичной гистоархитектоники и клеточных молекулярных структур, наличие полиморфных неорганизованных клеток (рис. 1).

Рис. 1. Рак толстой кишки: утрата типичной гистологической структуры в ходе неопластического процесса

Помимо установления самого факта злокачественной трансформации для назначения индивидуализированной терапевтической схемы важно как можно раньше определить гистологический тип опухоли и оценить стандартные маркеры агрессивности (степень дифференцировки, митотическая активность и т. д.). В пределах одного органа патологический процесс может развиваться по совершенно разным сценариям, вовлекать разнообразные клетки и структуры. Например, среди злокачественных новообразований легкого насчитывают, по современным представлениям, более шести гистологических типов, для каждого из которых необходимы свои терапевтические подходы (рис. 2) [1]. Мелкоклеточный рак легкого отличается стремительным течением, ранним метастазированием и очень плохим прогнозом. Карциноидные опухоли, происходящие из клеток диффузной нейроэндокринной системы, имеют наилучший прогноз; это единственный тип карцином легкого, который, как ныне считается, никак не связан с курением. Саркома легких — агрессивная опухоль, развившаяся из клеток соединительнотканных структур легкого. Аденокарциномы состоят преимущественно из железистых клеток и имеют периферическую локализацию. Опухоли этого типа зачастую развиваются у некурящих людей. Они могут нести активирующие мутации в генах EGFR, ALK и ROS1, которые являются терапевтической мишенью для действия таргетных препаратов — ингибиторов тирозинкиназ.

Рис. 2. Гистологические типы рака легкого: мелкоклеточный рак (14%); плоскоклеточный (эпидермоидный) рак (20%); аденокарцинома (38%); крупноклеточный рак (3%); карциноид (5%); мезенхимальные, в том числе саркомы и лимфомы (5%); опухоли смешанных типов — плоскоклеточный и аденокарцинома, аденокарцинома и мелкоклеточный и т.д. (15%)

Чтобы безошибочно установить гистологический тип опухоли в затруднительных ситуациях, вызванных, к примеру, маленьким размером образца или утратой опухолевыми клетками способности к образованию специфических структур (низкая степень дифференцировки), или выявить некоторые специфические характеристики новообразования, морфологи используют иммуногистохимическое окрашивание (ИГХ). Этот метод сформировался еще в середине 1980-х годов [2] и сразу стал одним из наиболее востребованных в клинической онкологии (рис. 3). Появление такого диагностического теста, например, существенно изменило роль патоморфологического исследования в лечении рака молочной железы: именно от результатов ИГХ-анализа на рецепторы к эстрогенам (ER) и прогестерону (PgR), которые синтезируется опухолевыми клетками при этом заболевании, зависит назначение эндокринной терапии. В настоящее время антагонисты эстрогенов, замедляющих деление клеток рака молочной железы, принимают примерно 70% пациенток [3]. С помощью ИГХ можно также обнаружить увеличение синтеза онкобелка HER2/neu (от англ. human epidermal growth factor receptor — рецептор эпидермального фактора роста, или трансмембранная рецепторная тирозинкиназа). Опухоли, вырабатывающие HER2/neu, оказались чувствительными к терапевтическим ингибиторам этой тирозинкиназы, и назначение соответствующих лекарственных препаратов (например, трастузумаба) основано на результатах тестов, в числе которых и ИГХ-анализ [4].

Рис. 3. Схема иммуногистохимического (ИГХ) метода и примеры его применения. Первичные антитела связываются с искомым антигеном (гормоном или его рецептором) и становятся видны в световой микроскоп благодаря соединению с вторичными антителами, мечеными ферментом, при этом пероксидазная активность выявляется с помощью 3,3-диаминобензидина (DAB). Справа приведены примеры оценки рецепторного статуса карцином молочной железы: ИГХ-реакция с антителами к рецепторам эстрогенов (а — негативная реакция, б — ядерное окрашивание, 100% клеток) и с антителами к HER2/neu (в — мембранное окрашивание, оценка 3+)

Диагностику опухолей сегодня невозможно представить без сочетания традиционного морфологического и молекулярно-генетического анализа. Первые мутации, ассоциированные с ответом опухолей на терапию, были обнаружены в прошлом десятилетии. Уже сейчас онкологические клиники применяют десятки молекулярных тестов, предназначенных для персонализации лечения. Еще недавно клиническое деление всех первичных опухолей легкого на мелкоклеточный и немелкоклеточный рак было достаточным для определения стратегии лечения. Ситуация изменилась с открытием активирующих мутаций в гене, который кодирует рецептор эпидермального фактора роста — EGFR, сделавших этот онкогенный белок избирательной мишенью для воздействия препаратов ингибиторов EGFR. Мутации EGFR, как правило, встречается у пациентов с аденокарциномой легкого. Таким образом, актуальной задачей стала дифференциальная диагностика между аденокарциномой и другими гистологическими разновидностями. Маркером первичных аденокарцином является ядерный белок TTF-1 [5]. Если ядра раковых клеток демонстрируют положительное окрашивание (рис. 4), то патоморфолог ставит диагноз «аденокарцинома», и в этом случае пациенту целесообразно подвергнуться молекулярному тестированию на предмет наличия в опухоли мутаций EGFR.

Рис. 4. Низкодифференцированная аденокарцинома легкого (а, среди фиброзной ткани отдельно расположенные опухолевые клетки) и положительная ИГХ-реакция с антителом к TTF-1 в ядрах опухолевых клеток (б)

В клиническом исследовании изучали эффективность EGFR-ингибитора (гефитиниба) на самом первом этапе лечения пациентов с мутацией EGFR [6]. Чтобы включить в исследование 25 больных, нам потребовалось проанализировать образцы тканей более 500 пациентов с раком легкого, что связано с низкой частотой этой мутации, которая в общей выборке больных не превышает 6–7%. Результаты исследования поражают воображение: эффект от препарата наблюдался у всех без исключения пациентов, в то время как аналогичный показатель при назначении стандартной терапии обычно не составляет 20–30% (рис. 5).

Рис. 5. Снижение размеров опухолевых очагов (%) в ответ на применение EGFR-ингибитора (гефитиниба) у пациентов с активирующими мутациями в гене EGFR: делецией 19-го экзона (19del) и заменой в 21-м экзоне (L858R) [6]

В настоящее время патоморфология переживает фундаментальные изменения. В стройную систему знаний, накопленных десятилетиями в рамках классической цитологии, гистологии и патологической анатомии, интегрируются новейшие представления о молекулярной патологии раковых клеток. Все это дает основания говорить о появлении новой дисциплины — молекулярной патологии [7]. Многие современные алгоритмы принятия врачебных решений уже ориентируются не столько на гистологические разновидности рака, сколько на молекулярные характеристики клеток. Однако роль патолога по-прежнему остается ведущей, поскольку именно он интегрирует все полученные сведения (микроскопические и молекулярные) в общий «портрет» опухоли.

Важность молекулярной морфологии в онкологии будет возрастать в ближайшем будущем, поскольку молекулярная диагностика больше не представляет собой однократное исследование, выполняемое только на этапе постановки диагноза. Многие современные технологии лечения рака предусматривают мониторинг характеристик опухолевых клонов на протяжении всех этапов онкологической медицинской помощи. В этом десятилетии большую популярность приобрели методы «жидкой биопсии», основанные на идентификации фрагментов опухолевых клеток в периферической крови. Другой важный аспект развития морфологии — ее интеграция с различными методами компьютерного анализа, искусственного интеллекта. На наших глазах морфология опухолей превращается из относительно консервативного раздела онкологии в одну из самых динамично развивающихся дисциплин современной медицины.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 16-04-00921).

Литература
1. Wistuba I., Brambilla E., Noguchi M. Chapter 17: Classic Anatomic Pathology and Lung Cancer // IASLC Thoracic Oncology. Pass H. I., Ball D., Scagliotti G. V. (eds) Aurora, Colorado, 2014; 217–240.
2. Taylor C. R., Burns J. The demonstration of plasma cells and other immunoglobulin-containing cells in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues using peroxidase-labelled antibody // J. Clin. Pathol. 1974; 27(1): 14–20.
3. Pertschuk L. P., Tobin E. H., Gaetjens E. et al. Histochemical assay of estrogen and progesterone receptors in breast cancer: correlation with biochemical assays and patients’ response to endocrine therapies // Cancer. 1980; 46(12 Suppl): 2896–2901.
4. Pegram M. D., Lipton A., Hayes D. F. et al. Phase II study of receptor-enhanced chemosensitivity using recombinant humanized anti-p185HER2/neu monoclonal antibody plus cisplatin in patients with HER2/neu-overexpressing metastatic breast cancer refractory to chemotherapy treatment // J. Clin. Oncol. 1998; 16: 2659–2671.
5. Stenhouse G., Fyfe N., King G. et al. Thyroid transcription factor 1 in pulmonary adenocarcinoma // J. Clin. Pathol. 2004; 57(4): 383–387. DOI: 10.1136/jcp.2003.007138.
6. Moiseyenko V. M., Procenko S. A., Levchenko E. V. et al. High efficacy of first-line gefitinib in non-Asian patients with EGFR-mutated lung adenocarcinoma // Onkologie. 2010; 33(5): 231–238. DOI: 10.1159/000302729.
7. Birner P., Prager G., Streubel B. Molecular pathology of cancer: how to communicate with disease // ESMO Open. 2016; 1(5): e000085. DOI: 10.1136/esmoopen-2016-000085.

Источник



Что такое молекулярно-генетическая диагностика

Молекулярно-генетическая диагностика — комплекс исследований, проводящихся для диагностики наследственных патологий. Генетическая диагностика может проводиться в ходе экстракорпорального оплодотворения.

В таком случае она называется преимплантационная генетическая диагностика. Методы исследований, применяющиеся для генетической диагностики, позволяют избежать рождения детей с наследственными заболеваниями.

Существуют сотни наследственных заболеваний. По статистике 5-6 детей из 100 рождаются с различными наследственными патологиями, выраженными в той или иной степени. Причина наследственных заболеваний — мутации.

Мутации — это патологическое изменение генетической информации на генном или хромосомном уровне. Мутации приводят к синтезу патологических белков, изменениям нормальных функций организма, болезни.

Наследственные заболевания приводят к тяжёлой патологии, не поддаются лечению, не имеют доступных методов, позволяющих облегчить состояние пациента. К примеру, адекватное лечение муковисцидоза и гемофилии требует около 250 000 долларов в год. Часть методов имеют чисто теоретическое значение, так как больной ребёнок погибает ещё до рождения.

Учитывая это, любой человек понимает, что такие заболевания лучше предупреждать. Для этого и служат молекулярно-генетические методы диагностики.

Ранее генетическая диагностика имела только несколько методов, не отличающихся высокой точностью и специфичностью. С развитием современных технологий, которые широко используют достижения молекулярной биологии и медицины, арсенал врачей заметно увеличился.

На сегодняшний день медики в состоянии поставить диагноз ещё до рождения ребёнка, благодаря следующим методам:

• генетическая консультация. Медицинский генетик строит генеалогическое дерево семей родителей. В случае наличия наследственной патологии у родственников, учитывая законы наследования, можно оценить риск возникновения заболевания у ребёнка. Метод применяется давно;
• анализ кариотипа. Кариотип — совокупность признаков, которые имеют хромосомы человека. С помощью специальной методики медицинский генетик может визуально проверить хромосомный состав клеток на наличие патологии. Метод хорошо зарекомендовал себя при диагностике грубых хромосомных нарушений, таких как синдром Дауна. Применяется сравнительно давно;
• полимеразная цепная реакция или ПЦР. В ходе анализа ПЦР могут диагностироваться различные генные патологии с высокой степенью точности, недоступной ранее. Например: фенилкетонурия, муковисцидоз, гемофилия и тд. На сегодняшний день один из самых доступных и точных методов;
• сложные лабораторные методы, позволяющие диагностировать различные патологии. Имеют высокую цену и редко проводятся в клинической практике. Например, полное картирование генома человека.

Особого внимания заслуживает метод, называемый предимплантационная генетическая диагностика. Преимплантационная генетическая диагностика проводится в ходе экстракорпорального оплодотворения или ЭКО. Для диагностики у эмбриона проводят забор клеток, которые направляют на исследование. С полученными клетками можно проводить любые вышеперечисленные анализы.

Метод имеет одно неоспоримое преимущество — диагноз точно устанавливается до беременности. Подлежат переносу только эмбрионы, не имеющие генетических патологий.

Другая альтернатива — пренатальная диагностика. В этом случае, во время беременности проводятся анализы крови, околоплодной жидкости, плодных оболочек. В случае обнаружения патологии беременность прерывают.

В отличие от пренатальной диагностики, предимплантационная генетическая диагностика не требует прерывания беременности. Не возникает риска прерывания беременности в ходе исследования. Единственным минусом данного метода является достаточно высокая цена.

Диагностика генетических заболеваний проводится по медицинским показаниям и после направления в центр генетической диагностики. Любая пара, планирующая беременность, может по собственной инициативе пройти обследование с применением методов молекулярно-генетической диагностики. И напротив, никто не может заставить проходить эти процедуры без согласия пациента.

Генетическая диагностика требует наличия сложного оборудования, грамотных специалистов и хорошего финансирования. По этой причине были созданы специализированные учреждения — центры молекулярно-генетической диагностики.

Головное учреждение — Центр Молекулярно-Генетической Диагностики Российской Академии Медицинских Наук.

Источник

Молекулярно-генетические методы исследования и их применение в медицине

Прямая диагностика мутаций включает несколько методов :

• определение нуклеотидной последовательности (секвенирование);
• выявление нарушения места рестрикции;
• аллельспецифическую гибридизацию с синтетическими олигонуклеотидными зондами;
• химическое и ферментативное расщепление ДНК в местах неправильного сшивания оснований;
• регистрацию изменения электрофоретической подвижности мутантных молекул ДНК;
• трансляцию белкового продукта in vitro.

Метод нуклеотидной последовательности

• Непосредственная диагностика патологических мутаций путем определения нуклеотидной последовательности является наиболее точным методом.

Позволяет достоверно выявлять:

• замены оснований,
• делеции
• вставки на всем протяжении изучаемого фрагмента.

Метод нуклеотидной последовательности

• трудоемкость секвенирования
• высокая стоимость ,

что частично ограничивает применение этого

варианта прямой детекции мутаций.

Перспективы : развитие автоматизации

секвенирования позволяет надеяться, что в будущем

этот метод займет ведущее место в диагностике

Метод выявления мутаций по нарушению рестрикции

• Выявление нарушения места рестрикции осуществляется с помощью блот-гибридизациипоСаузерну .
• При обработке соответствующей рестриктазой в геле отсутствуют фрагмент ДНК, выявляемый у нормальных индивидов.
• Примерно 50% нуклеотидных замен приводит к изменению места (или сайта) рестрикции, благодаря чему возможна прямая детекция мутаций на основе рестриктного анализа.

Метод выявления мутаций гибридизацией с зондом

• Аллельспецифическая гибридизация с олигонуклеотиднымизондами позволяет обнаруживать мутации в геномной ДНК
• Последовательность оснований в олигонуклеотидном зонде может быть задана по нормальному или патологическому варианту гена , затем помечена
• И в том, и в другом случае такой зонд используется для гибридизации с фрагментом ДНК обследуемого индивида.

Метод выявления мутаций по расщеплению ДНК

• Химическое (или ферментативное) расщепление ДНК в местах неправильной сшивки оснований выявляет большую группу мутаций , ведущих к нестабильности ДНК.
• Мутации в молекуле ДНК могут изменять электрофоретическую подвижность фрагмента ДНК .

Метод выявления мутаций по расщеплению ДНК

• Во-первых, могут изменяться температурные показатели плавления двухцепочечных фрагментов , что можно определить с помощью электрофореза двухцепочечной ДНК в градиентном денатурирующем геле (так называемый денатурирующий гель-электрофорез).

Метод выявления мутаций по расщеплению ДНК

• Во-вторых , в результате мутации изменяться конформация одноцепочных фрагментов, что выявляется путем электрофореза предварительно денатурирующих ДНК в неденатурирующих условиях
• В-третьих , проводиться так называемый гетеродуплексный анализ, с помощью которого обнаруживаются нарушения линейности гетеродуплексов в местах коротких вставок и делеций

Суть этого варианта электрофорез ДНК в нейтральном или равномерно денатурирующем геле

Источник

Методы молекулярно генетического анализа реферат

ФГБУ «Поликлиника №1» Управления Делами Президента РФ

Молекулярно-генетическая лаборатория: необходимость, назначение, перспективы

Журнал: Лабораторная служба. 2012;(2): 20-25

Садыков Т. Ф., Волкова Ю. В., Кудрявцева Л. В. Молекулярно-генетическая лаборатория: необходимость, назначение, перспективы. Лабораторная служба. 2012;(2):20-25.







В статье описаны преимущества молекулярно-биологических методов диагностики. Обоснована необходимость персонализации медицинских мероприятий, основанных на превентивном генетическом обследовании конкретного пациента. На примере ФГБУ «Поликлиника №1» Управления делами Президента РФ описан опыт планирования современной молекулярно-генетической лаборатории, включающей ПЦР-диагностическое и генетическое исследования.

ФГБУ «Поликлиника №1» Управления Делами Президента РФ

В настоящее время клиническая практика располагает достаточно широким спектром методов лабораторной диагностики, позволяющим не только диагностировать заболевания, мониторировать терапию, но и осуществлять контроль лечения. До недавнего времени методы лабораторной диагностики, используемые в клинической практике, имели один общий недостаток — они не учитывали предрасположенность пациента к различным заболеваниям согласно генетическим факторам. Вопросы предрасположенности пациента к различным заболеваниям лежат в основе нового направления медицины — персонализированной медицины, которую можно определить как стратегию, профилактику и лечение заболеваний на основе результатов молекулярно-генетических исследований.

Благодаря научным исследованиям стало известно, что в развитии различных заболеваний большую роль играют генетические полиморфизмы — изменения генома, встречающиеся в человеческой популяции, по крайней мере, в 2 вариантах (аллелях) с частотой не менее 1%. Наиболее частым типом генетического полиморфизма являются однонуклеотидные замены (SNP), которые генетически уникальны для каждого человека [1]. Некоторые полиморфные варианты генов («гены предрасположенности») при определенных неблагоприятных условиях могут способствовать развитию мультифакториальных заболеваний. Неблагоприятные аллельные варианты этих генов могут быть причиной таких частых болезней, как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца (ИБС), остеопороз, сахарный диабет, бронхиальная астма, опухоли и др. Сочетания аллельных вариантов различных генов, обеспечивающих нормальный метаболический процесс или вовлеченных в развитие конкретной патологии, получили название «генные сети». Выяснение составляющих генной сети каждого мультифакторного заболевания, разработка на этой основе комплекса профилактических мероприятий для конкретного пациента составляют основу предиктивной (предсказательной) медицины.

В настоящее время молекулярно-диагностические технологии развиваются, совершенствуются и внедряются в клиническую практику. Так, уже сейчас клиническая лабораторная диагностика располагает широким спектром методов, основанных на выявлении и диагностике методами анализа нуклеиновых кислот — полимеразная цепная реакция (ПЦР), генотипирование, биочипы, секвенирование и т.д.

ПЦР — один из немногих, используемых в настоящее время в клинической практике методов лабораторной диагностики, характеризующийся высочайшими специфичностью и чувствительностью в выявлении таких заболеваний, как бактериальный вагиноз, трихомониаз, сифилис, вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекция, туберкулез и др. [2, 3].

Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении трудно культивируемых и некультивируемых вирусов и бактерий, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях. Следует отметить, что диагностические возможности ПЦР, в отличие от бактериологического и вирусологического методов диагностики, не ограничены способностью микроорганизмов и вирусов расти на искусственных средах или в культуре клеток. Основное преимущество ПЦР перед бактериологическим и вирусологическими методами диагностики состоит в способности идентифицировать, определять свойства и работать с большим разнообразием микроорганизмов, которые не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях.

На рис. 1 Рисунок 1. Сравнительный анализ чувствительности (%) диагностических методов, применяемых для выявления Neisseria gonorrhoeae (Ng), Chlamydia trachomatis (Ct), Trichomonas vaginalis (Tv). МС — микроскопия, БП — бактериологический посев, ИФА — иммуноферментный анализ, ПИФ — прямая иммунофлюоресценция. показаны результаты сравнения чувствительности различных методов, применяемых в клинической лабораторной диагностике для выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем — N. gonorrhoeae, C. trachomatis и T. vaginalis.

ПЦР-диагностика также очень эффективна в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Помимо этого, ПЦР имеет следующие преимущества перед другими методами клинической лабораторной диагностики:

— универсальность (способность обнаруживать любые ДНК и РНК бактерий и вирусов даже в случаях, когда другими методами лабораторной диагностики это сделать невозможно); вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов;

— высокая специфичность (до 100%) метода обусловлена тем, что благодаря подбору специфических праймеров определяется уникальный фрагмент ДНК или РНК, характерный только для данного возбудителя;

— высокая чувствительность (в настоящее время порог чувствительности некоторых амплификационных тест-систем позволяет определять единичные копии в исследуемом образце [4]);

— высокие технологичность и автоматизация метода позволяют получать результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения исследования;

— выполнение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.;

— возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата исследования.

В настоящее время с использованием метода ПЦР разработаны методы исследования генома человека — секвенирование по Сэнгеру, Эдману, пиросеквенирование. Цель данных исследований — определение последовательности нуклеотидов. Уже сейчас в клиническую практику внедряется метод пиросеквенирования, основанный на принципе «секвенирование путем синтеза». При включении нуклеотида в исследуемую цепь ДНК высвобождаются пирофосфаты, затем происходит цепь химических реакций с их участием, что приводит к образованию квантов света. Интенсивность свечения определяется специальным прибором. В настоящее время разработаны серии реагентов, позволяющие определять предрасположенность к заболеваниям сердечно-сосудистой системы (артериальная гипертония, инфаркт миокарда), сахарному диабету, ожирению, остеопорозу, бронхиальной астме и т.д. При получении данной информации врач может разработать для пациента индивидуальные рекомендации по профилактике, а пациент, в свою очередь, может принять своевременные меры и тем самым предотвратить развитие заболевания.

Особенно важным является изучение полиморфных генов, ответственных за метаболизм антикоагулянта варфарина. Известно, что три единичных нуклеотидных полиморфизма (SNP), два гена в CYP2C9 и один в VKORC1 играют ключевую роль в определении влияния терапии варфарином на коагуляцию. Носители определенных аллелей этих генов подвергаются более высокому риску кровотечений при применении стандартных доз варфарина. Для таких пациентов проводится индивидуальный подбор терапии.

Молекулярно-генетические исследования являются неотъемлемой частью диагностики и выбора лечения в современной онкологии. В настоящее время стала возможной разработка лекарственных препаратов, действующих непосредственно на молекулярную мишень в опухолевой клетке, не вызывая серьезного повреждения других органов и тканей пациента. Применение таких препаратов носит название «таргетная терапия». Большое значение имеет также выявление наследственно обусловленных форм рака. Применение новых препаратов, ориентированных на «точечное» воздействие на молекулярные механизмы, обусловливает необходимость обязательной идентификации генетических нарушений.

Детекция генетических нарушений методом аллельспецифичной ПЦР в реальном времени (PCR-HRM) позволяет относительно быстро проводить детекцию и количественное определение мутаций в онкогенах, что необходимо для назначения схемы лечения и контроля эффективности терапии. Используя метод пиросеквенирования, можно также определять наиболее часто встречающиеся мутации в онкогенах BRCA1 и BRCA2, являющиеся причиной наследственно обусловленного рака молочной железы, яичников, поджелудочной железы, простаты. Применение современных диагностических подходов для выявления соматических мутаций в онкогенах и определения генетической предрасположенности к развитию рака позволяет проводить целенаправленное лечение в зависимости от индивидуального генотипа некоторых видов рака.

Описанные выше методы относительно доступны для любого лечебно-профилактического учреждения за счет использования услуг сторонних коммерческих лабораторий. В то же время необходимо отметить, что, если диагностика инфекционных заболеваний методом ПЦР — это широко распространенная услуга, то диагностика генетических предрасположенностей пациента — относительно новое направление, поэтому количество адекватных предложений на рынке диагностических услуг пока ограничено.

Кроме того, при работе со сторонними лабораториями клинико-диагностическая лаборатория (КДЛ) сталкивается с большим количеством проблем на всех этапах анализа. На преаналитическом этапе использование услуг сторонних лабораторий часто влечет за собой необходимость использования дополнительных расходных материалов для сбора и транспортировки биологического материала, отличающихся от используемых в КДЛ. При этом КДЛ, как правило, вынуждена отказаться от универсальной методики забора биологического материала, что может повлечь ошибки как со стороны клиницистов, так и на этапе сортировки и транспортировки биологического материала: на аналитическом этапе — отсутствие возможности контроля качества выполняемых работ и оперативной информации об использовании той или иной методики проведения определенного исследования, на постаналитическом этапе — значительные сроки выдачи результатов, необходимость приведения единиц измерения к привычным для клиницистов [5].

Очевидно, что себестоимость исследования при передаче его на аутсорсинг будет значительно выше себестоимости аналогичных услуг, предлагаемых пациентам аутсорсером. Таким образом, сторонняя коммерческая лаборатория получает значительное конкурентное преимущество в борьбе за пациента.

Учитывая эти обстоятельства, большинство лечебно-профилактических учреждений, использующих в своей работе ПЦР-диагностику и диагностику генетических предрасположенностей, стремятся к оснащению собственных КДЛ соответствующим оборудованием.

Примером успешной работы по организации рабочих процессов в КДЛ является ФГБУ «Поликлиника №1» Управления делами Президента Российской Федерации. За последнее время в КДЛ поликлиники реализован комплекс мер по модернизации парка оборудования и организации бизнес-процессов, позволивший повысить доход КДЛ по сравнению с аналогичными периодами прошлых лет в 3 раза [5].

В настоящий момент КДЛ ФГБУ «Поликлиника №1» отвечает современным стандартам лабораторной диагностики. В прейскурант услуг КДЛ включен широкий спектр лабораторных исследований: общеклинические, микроскопические, гистологические, цитологические, иммунологические, биохимические исследования, диагностика инфекций, генетические исследования [6].

Вместе с тем такие направления, как диагностика инфекций методом ПЦР и генетические исследования, производятся силами сторонней коммерческой лаборатории. Руководство поликлиники, следуя по намеченному пути модернизации КДЛ, приняло решение о создании на базе КДЛ геномного центра, силами которого планируется проводить исследования в рамках этих направлений. Этот шаг позволит КДЛ не только значительно снизить издержки по существующему и приносящему немалую часть дохода направлению ПЦР-исследований, но и освоить и развить новые технологии генетических исследований.

При планировании центра было решено исходить из следующих задач:

— организация высокопроизводительной ПЦР-диагностической лаборатории;

— организация генетической лаборатории;

— максимальная автоматизация всех этапов лабораторного процесса;

— использование оборудования «открытого» типа, позволяющего понизить зависимость лаборатории от поставщиков тест-систем;

— возможность интеграции геномного центра в лабораторную информационную систему КДЛ (ЛИС «АЛТЕЙ»);

— полная совместимость методик забора биологического материала с уже используемыми;

— максимальное следование официальным инструкциям и рекомендациям по организации лабораторий, работающих с молекулярно-биологическими методами в целях повышения безопасности и качества оказания услуг.

С учетом необходимости выдачи наиболее точных результатов в качестве основы ПЦР-лаборатории был выбран широко распространенный в научных и практических медицинских учреждениях прибор Rotor-Gene Q («QIAGEN», Германия; рис. 2). Рисунок 2. Амплификатор Rotor-Gene Q («QIAGEN», Германия). Автоматизацию пробоподготовки и приготовления ПЦР-смесей решено проводить с помощью роботизированных станций «открытого» типа Neon 100 («Xiril AG», Германия; рис. 3). Рисунок 3. Роботизированная станция Neon 100 («Xiril AG», Германия).

Для проведения генетического анализа запланировано использование двух технологий: пиросеквенирования и технологии анализа биочипов высокой плотности.

Технология пиросеквенирования в полной мере реализована на приборе PyroMark Q24 («QIAGEN», Германия), который был запланирован в качестве прибора, на котором будут проводиться повседневные генетические исследования (рис. 4). Рисунок 4. Пиросеквенатор PyroMark Q24 («QIAGEN», Германия).

Самым дорогостоящим прибором в запланированном составе молекулярно-генетической лаборатории стал сканер для биочипов высокой плотности iScan System («Illumina», США; рис. 5). Рисунок 5. Сканер для биочипов высокой плотности iScan System («Illumina», США). Это оборудование характеризуется высочайшим качеством получаемых данных, высокой производительностью и гибкостью. Так, при использовании одного биочипа можно проанализировать почти 5 млн различных признаков на 4 образцах одновременно.

Как показывает практика, для повышения эффективности работы КДЛ недостаточно только модернизировать парк оборудования. Оно является основой, которую необходимо выстроить таким образом, чтобы обеспечивать решение всех поставленных задач.

Учитывая особенности работы с методами амплификации нуклеиновых кислот, при планировании помещений для размещения молекулярно-генетической лаборатории руководство поликлиники использовало ряд санитарно-эпидемиологических правил и норм (СП) [7]. Кроме того, в работе были использованы соответствующие методические указания (МУ), разработанные на основе СП [8]. Помимо уверенности в высоком уровне качества и безопасности работы в КДЛ, следование этим МУ позволит облегчить процесс получения соответствующего разрешения на работу с патогенами в надзорных органах.

В соответствии с упомянутыми МУ при строительстве новых или реконструкции имеющихся помещений лабораторию размещают в отдельно стоящем здании (или, как в Поликлинике №1, изолированной части этажа) с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 и(или) СП 1.3.2322-08 [7].

Организация работы лаборатории основана на разделении ее на 5 рабочих зон, соответствующих этапам проведения анализа, поточности движения персонала и материалов: 1) зона выделения нуклеиновых кислот; 2) зона приготовления ПЦР-смесей; 3) зона проведения реакции амплификации и детекции продуктов амплификации; 4) зона подготовки материала для генетического анализа; 5) зона проведения генетического анализа (рис.6). Рисунок 6. План размещения геномного центра в помещениях лечебно-профилактического учреждения.

Ввиду контаминационной опасности рабочая зона генетической части лаборатории дополнительно отделена от остальных помещений в соединяющем коридоре.

С учетом запланированной высокой пропускной способности все ключевые элементы лаборатории связаны не только в поточной схеме, но и соответствующим программным обеспечением. В качестве связующего звена предложено использовать программу «FRT-Manager». Эта программа специально разработана для лабораторий, работающих с методами амплификации нуклеиновых кислот, легко интегрируется в функционирующую в КДЛ ЛИС «АЛТЕЙ» и позволяет максимально автоматизировать процесс интерпретации данных, полученных в результате проведения исследований.

Таким образом, использование высокотехнологичного оборудования в молекулярно-генетической лаборатории, создаваемой на базе ФГБУ «Поликлиника №1» Управления делами Президента Российской Федерации, позволит стать крупным диагностическим центром, проводить точную диагностику инфекционных заболеваний, анализировать геном пациента с целью выявления предрасположенностей к тем или иным заболеваниям для своевременного осуществления превентивных мер в индивидуальном порядке. Наличие такого центра позволит перевести медицинское обслуживание в ФГБУ «Поликлиника №1» Управления делами Президента Российской Федерации на качественно новый уровень и составить соответствующую конкуренцию коммерческим генетическим лабораториям на рынке лабораторных услуг.

Источник